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圖1 PMA™是一種DNA高親和力的光反應染料，染料嵌入雙鏈DNA暴露在強烈的可見光下形成共價連接，形成化學修飾DNA，不能經PCR擴增。由于PMA™的設計是細胞膜不透性，檢測包含活、死細菌樣本時，只有死細菌由于其細胞膜損害，其DNA敏感的被PMA修飾。隨后可以通過定量PCR選擇性的檢測活細菌。
PMA™ 高效選擇和靈敏的檢測死細菌中存在的活菌數在許多實際應用，包括安全檢查，食品，飲用水的質量控制，醫療診斷等方面至關重要。傳統使用細菌培養的檢測方法，既費時又不靈敏。
建立在qPCR上的檢測，是一個快速，專一，高度靈敏的替代方法。然而，普通qPCR并不能區分活死細胞。由Biotium開發的新型DNA修飾染料-疊氮碘化丙錠 (PMA™) 克服了該難題。用PMA預處理的樣本用于PCR分析，為選擇性的檢測活細菌提供一個高度敏感和可靠的方式。
圖2(A) 表示使用PMA™預處理的活、死大腸桿菌實時PCR定量分析示意圖。利用PMA™-qPCR檢測活的及熱滅活的大腸桿菌
qPCR 所用引物對應16S rRNA 的一段。
圖2(B) 活、死大腸桿菌經PMA™處理和未經PMA™處理的dCt。(dCt = Ct with PMA™ – Ct without PMA™).
PMAxx™是Biotium開發的高親和性的光反應DNA結合染料，是PMA的升級版。染料本身發微弱熒光，和核酸結合后發強烈熒光。染料高親和性地優先結合dsDNA。一經光解，光敏性的疊氮基團轉變成高活性的氮烯自由基，氮烯分子能夠更容易地在結合位點與任何碳氫化合物反應形成穩定的共價N-C鍵，從而形成永久的DNA修飾。染料是細胞膜不透性的，因此能夠用來選擇性地修飾死細胞因膜不完整而暴露的DNA，而擁有完整細胞膜的活細胞中DNA不能被修飾。PMAxx 通過純化時將被修飾DNA移除和通過DNA聚合酶抑制模板擴增來達到抑制被修飾DNA模板擴增的目的(Nocker et al. 2006)。染料的這個特性使其在實時定量PCR選擇性檢測致病菌時非常有用。
實驗室菌種分析表明，與PMA相比，PMAxx將活細胞與死細胞的不同提高到比PMA高3-7 Ct。因此PMAxx用于viability PCR能更有效區分活死細菌。PMAxx 與PMA原理相同，在現有的PMA-PCR流程中能直接替代PMA。
Differentiation of live and dead bacteria using PMAxx™ vs. PMA™ in untreated and heat-killed B. subtilis.
了解更多請下載 PMA™ and PMAxx™ flyer 或者PMAxx™ product information.
在溫和滅活細菌的情況下，細菌可能被殺死但是保留完整的細胞膜，PMA™難以滲入其中。這樣會導致對活細菌的估計過高。Biotium 研發出了用于革蘭氏陰性菌的增強劑，與PMA™ 或PMAxx™一起作用能大大提高活、死細胞區別。
增強劑的優勢如下：
1）提高了革蘭氏陰性菌的活、死細胞區別。
2）在溫和滅活細菌的情況下大大地提升PMA™的效率。
溫和滅活大腸桿菌PMA™或 PMA™+增強劑處理，接著用PMA-Lite™曝光并提純DNA。Fast EvaGreen® qPCR Master Mix用于擴增大腸桿菌DNA377-bp片段。與PMA™單獨處理的死細胞相比，PMA™+增強劑處理過的死細胞Ct顯示出更進一步的延遲。
PMA™-PCR試劑盒使用PMA™染料及實時PCR選擇性檢測活細菌。試劑盒包含PMA™染料，Fast EvaGreen® qPCR Master Mix，用于檢測食品安全，公共衛生， 抗菌研究廣泛關注的菌株的經驗證的PCR引物。
試劑盒包含：
• PMA™ 染料
• Fast EvaGreen® qPCR Master Mix
• ROX 校正染料
• 僅適用于革蘭氏陰性菌的5X PMA™ 加強液
• 特定菌株經驗證的PCR引物
PMA Real-Time PCR 細菌活力檢測試劑盒適用于:
• 沙門氏菌
• 金黃色葡萄球菌
• 抗藥性金黃色葡萄球菌
• 大腸桿菌
• 結核桿菌
• 李斯特菌
詳情請下載 PMA Real-Time PCR Kits.
Biotium 提供 PMA-Lite™ LED photolysis device 可以在時間和溫度上控制光照的時間適用于PMA染料及其他常見染料。
PMA-Lite™ LED Photolysis Device.
詳情請下載 PMA-Lite™ LED Photolysis Device.
